Howard Hughes Medikal Enstitüsü Janelia Farm Araştırma Kampüsü bilim insanları tarafından icat edilen yeni mikroskop, araştırmacıların tek/yalnız canlı hücrelerin içini dikkatle tarayıp, hücre sınırlarının açıklayıcı üç boyutlu modelini eşi benzeri görülmemiş detaylarıyla ortaya çıkaran -süpermarketlerdeki ince barkod tarayıcılar benzeri- aşırı ince ışık katmanı kullanmalarına olanak sağlayacak. Mikroskopi tekniği yüksek hızda görüntüleme yapabiliyor, böylece araştırmacılar hücre bölünmesi gibi biyolojik süreçleri canlandıran göz kamaştırıcı filmler yaratabilecekler.
Bessel ışını düzlem aydınlatma mikroskopisi denilen bu teknik 4 Mart 2011’de Nature Methods dergisinde online olarak yayımlanan bir araştırma makalesinde anlatılıyor.
Biyologların başlıca amacı hücre içindeki moleküler süreçlerin prensiplerini anlamak. Janelia Farm grup lideri Eric Betzig “Eğer biri oyunun kurallarını öğrenmeye çabalıyorsa, bu oyunun fotoğraflarına bakmak yerine o oyunu oynayan insanların bir filmini izlemesi daha avantajlıdır. Aynı şey hücreler için de geçerlidir.” şeklinde durumu açıklıyor. Kendisi 30 yıldan fazla zamandır mikroskopları icat etme ve geliştirme üzerinde çalışıyor. Bu süre içerisinde mikroskopide büyük gelişmeler görülmesine rağmen, Betzig’e göre, birçok mikroskopi tekniğinin hücreleri öldürmeyi ve hücreyi görüntüleme pozisyonuna yerleştirmeyi gerektirmesi bu alandaki bilimsel çalışmalara engel oluyordu. Betzig aynı zamanda “Durağan resimler gibi olan ölü hücrelerden öğrenilebilecek şeyler sınırlıdır” diyor.
Betzig, araştırmacılara canlı hücrelerin iç yaşamını görme olanağı sağlayan bir mikroskop yaratmak istemiş. Floresan moleküllerle işaretlenmiş protein ve diğer moleküllerin oluşturduğu noktalarca resmedilmiş canlı hücrelerle çalışma fikri yeni değil. Fakat canlı-hücre teknikleri, mikroskop tarafından üretilen ışık zamanla hücreye zarar verebileceği için problemli olabilir. Hücreye verdiği hasarın yanı sıra ışık, sayısı çok fazla olan floresan moleküllerinin zamanla parlaklığını kaybetmesine neden olur. Diğer bir deyişle, hücreyle onun özelliklerini ortaya çıkarmak için ne kadar uzun çalışırsanız, hücreye o kadar çok hasar verirsiniz ve muhtemelen bir o kadar da “foton bütçenizden” harcarsınız, diyor Betzig.
Dahası, bir mikroskobun ışığı numunenin odaklanılan küçük parçasından daha fazlasını ışıklandırır. Odak dışı bölgelerin aydınlatılması, küçük hücre-içi özelliklerin keskin noktalar yerine uzatılmış lekeler olarak ortaya çıktığı bulanık bir görüntü üretir. Betzig’e göre buradaki soru, neden olunan zararı minimuma indirmenin bir yolunun olup olmadığı. Geliştirdikleri teknikle hücrelerin fizyolojik durumlarını bozmadan uzun zamanlı ve yüksek çözünürlüklü çalışma fırsatı oluşacak.
Betzig, 2006’da Janelia Farm’a gitmesinden çok önce canlı-hücre misroskopisini geliştirme yolları düşünmeye başlamış. O, (kırınım yasaları tarafından dayatılan) uzaysal çözünmenin limitlerine zarar verecek olan yeni mikroskopi tekniklerini tasarlamaya odaklanmışken bu düşüncelerini bir süre saklamış. Yakın zamana kadar mikroskoplar 200 nanometreden daha küçük boyutlardaki objeleri görüntüleyemiyordu. Birkaç yıl önce, Betzig ve Janelia Farm’dan meslektaşı Herald Hess sadece 10-20 nanometre boyutlarındaki objeleri görüntüleyebilen PALM’ı (photoactivated localization microscopy-aktive edilmiş ışık yerelleştirme mikroskopisi) icat etmişler.
PALM ve çoğu mikroskop -hatta üniversite öğrencilerinin biyoloji sınıflarında kullandıkları bile- numuneyi bir objektif lens üzerinden ışığa maruz bırakıp daha sonra geri dönen ışığı aynı lens üzerinde toplaması şeklinde çalışır. Bu yol ışığın numuneye zarar vermesine ve bulanıklığa neden olur, bu yüzden canlı hücreleri gözlemlemeyi zorlaştırır.
2008 yılında Betzig bu zorluğun üstesinden gelmenin yolları üzerinde çalışmaya başlamış. Sahip olduğu fikirlerden biri de düzlem aydınlatma mikroskopisini kullanmak. İlk olarak 100 yıl kadar önce önerilen düzlem aydınlatması, numunenin üst kısmı yerine yan yüzünden gelen parlayan bir ışık katmanı içerir. Bunu yapmak için mikroskop uzmanları birbirlerine dik iki farklı objektif lens kullanırlar. Betzig durumu: “Yan kısımlardan geldiğiniz için düzlem aydınlatma, odaklanan kısma çok yakın olan eksitasyonu (uyarılma) sınırlar” şeklinde açıklıyor.
Düzlem aydınlatma, Janelia Farm akademi üyesi Philipp Keller de dahil olmak üzere diğer araştırmacılar tarafından, yüzlerce mikron boyutlarındaki çok hücreli organizmaları incelerken etkiyi artırmada kullanılmasına rağmen, ışık katmanları sadece 10 mikron boyutundaki hücrelerin içini efektif şekilde görüntülemek için hâlâ çok kalındı. Asıl problem, Betzig’in grubunun istediğinden daha fazla hücrenin düzlem aydınlatmadaki geniş ışık şeritlerine maruz kalmasıydı. Bu durum aşırı bulanıklığa ve hafif toksisiteye sebep oluyordu. Bu problemi aşmak için Betzig ve grubu, kırınıma uğramayan özel tip ışık demeti olan Bessel ışınlarını kullanmış. Bessel ışınları, 1980’lerin sonunda fizikçiler tarafından incelenmiş ve bugün süpermarketlerde kullanılan barkod tarama cihazlarını da içeren uygulamalarda kullanılıyor. Betzig’in grubu numune üzerinde ışın tarama yapmanın daha ince bir ışık katmanı yarattığını keşfetmişler.
Bessel ışınları biraz garip hareket ederler, bu yüzden bu ışınlar Betzig’in doktora sonrası araştırmacılarını (Thomas Planchon ve Liang Gao) beş yıldan fazla süredir meşgul etmekte. Bessel ışınları çok dar ışık demeti üretmesine rağmen, odak noktasının yan kısmında bir miktar zayıf ışık da yaratır, bu da aydınlanma şablonunun mercek şeklinde (bull’s eye) görünmesine neden olur. Ekstra ışık lopları numunenin çoğunu harekete geçirdiği için engel teşkil eder. Betzig’in grubu bu durumu telafi etmek için iki yöntem kullanmış. Bunlardan ilki, “yapılandırılmış aydınlatma” adındaki konsept. Burada ışınları sürekli olarak hızlı bir şekilde yaymak yerine onları seri bir şekilde açıp kapıyorlar (makineli tüfek gibi). Bu durum odak dışı bulanıklığı gidermede kullanılabilecek periyodik kademeli eksitasyon oluşturmayı sağlıyor. (Janelia Farm grup lideri Mats Gustafsson tarafından kullanılan yapılandırılmış aydınlatma, ayrıca süper çözünürlüğü elde etmenin de bir yolu.)
Betzig’in grubunun kullandığı diğer bir strateji ise iki fotonlu mikroskopi. Bu metot çoğunlukla nörobilimde kalın beyin dokusu parçalarının görselleştirilmesinde kullanılıyor. İki fotonlu mikroskopların avantajlarından biri zayıf bir biçimde ışığa maruz bırakılan bölgeler tarafından çok küçük floresan sinyalleri üretmesi. Böylece iki fotonlu metot uygulandığında Bessel tarafındaki lopların arka planı elenir ve geriye kalanlar da Bessel ışınlarının dar merkez bölümündeki ışıktır.
Daha sonra olabildiğince hızlı bir şekilde görüntüleme yapmaya koyulmuşlar. Bessel ışınları hızlı bir şekilde numunenin üzerinde yayılıyor; böylece grup saniyede yaklaşık 200 görüntü alabilmiş ve yüzlerce iki boyutlu götünden 1-10 saniye içinde üç boyutlu yığınlar oluşturulmuş. Umdukları gibi, hücreye zarar vermeden yüzlerce üç boyutlu görüntü kümeleri elde edebilmişler. Böylece mitoz bölünme gibi hücresel süreçlerin inanılmaz filmlerini oluşturabildiklerini keşfetmişler. Betzig “Uzaysal ve zamansal detayları görüntülemeye bu kadar yaklaşabilen başka bir teknik yok” diyor.
Geçen yaz, ilk canlı hücre görüntülerini elde eder etmez, Betzig, Plancho ve Gao yeni aletlerini kiralık bir spor hizmet aracına koyup onu, Ulusal Sağlık Enstitüsü’nden yardımcı yazarlar Jim ve Cathy Galbraith ile birlikte çalıştıkları fizyoloji dersi için Massachusetts’teki Woods Hole Deniz Biyolojisi Laboratuvarına götürmüşler. Betzig, “Biz burada neyin işe yarayıp neyin yaramadığına, görüntüleme yaparken bir şekilde kendi fizyolojik durumlarını koruyan hücreleri tedavi etmenin yollarına dair bir sürü şey öğrendik.” diyor. “Bütün mikroskoplar gibi enstrümantasyon da yapbozun sadece bir parçasıdır. Bunun önemli kısmını ise doğru numuneleri bulmak ve doğru hazırlama metotlarını kullanmak oluşturur.” şeklinde de açıklamasına devam ediyor.
Yeni mikroskop heyecan verici, çünkü gelecekte süper çözünürlükte mikroskopların geliştirilmesi için de kullanılabilir. PALM ve diğer süper-çözünürlük teknikleri ince ve ölü numuneleri gözlemlemek için oldukça sınırlı. Aynı zamanda canlı olanları gözlemlerken de onlara zarar verebilir. Betzig bununla ilgili olarak “Bessel’le ilgili gerçekten mükemmel olan şey ise şudur; biz uyarı seviyesini (excitation) sınırlayabilir ve daha kalın yapıdaki hücrelerin yapılarını ya da dinamiklerini araştırmada süper-çözünürlük mikroskopisini uygulamayı gerçekten düşünmeye başlayabiliriz.” diyor.
Süper çözünürlük olmasa bile, Bessel ışınları düzlem aydınlatma mikroskopisi, hücre biyologları için çok güçlü bir araç olacak. Bunun nedeni, yayılma göstermeyecek şekilde, hücrelerin üç boyutlu karmaşıklığını görüntülemeye olanak sağlaması.
Kaynak: http://www.sciencedaily.com/releases/2011/03/110304151010.htm
