Geçtiğimiz 10 yılda CRISPR-Cas9 gen düzenleme tekniği, genetik mühendisliğinde bir devrim yaratarak, bilim insanlarının, organizmaların DNA’sında özel olarak hedef alınan değişiklikler yapmasına olanak sağladı. Bu teknik çeşitli hastalıkların tedavisinde kullanılabilir ancak CRISPR-Cas9 gen düzenlemesi DNA ipliklerini keserek hücrenin genetik materyalinde kalıcı değişikliklere yol açar.
9 Nisan günü Cell’de yayınlanan bir makalede, araştırmacılar DNA dizisini değiştirmeden gen ifadesini yüksek özgünlükle kontrol etmelerine olanak tanıyan “CRISPRoff” adlı yeni bir gen düzenleme teknolojisini açıklıyor. Whitehead Enstitüsü’nden Jonathan Weissman, Kaliforniya San Francisco Üniversitesi’nden Luke Gilbert, Weissman Laboratuvarı doktora sonrası araştırmacısı James Nuñez ve meslektaşları tarafından tasarlanan yöntem, yüzlerce hücre bölünmesi yoluyla nesilden nesile aktarılabilecek kadar kararlı ve aynı zamanda tamamen geri döndürülebilir.
Aynı zamanda MIT’de biyoloji profesörü ve Howard Hughes Tıp Enstitüsü’nde araştırmacı olan Weissman, “Buradaki büyük hikaye, artık genlerin büyük çoğunluğunu susturabilecek basit bir araca sahip olmamız” diyor ve ekliyor: “Bunu herhangi bir DNA hasarı olmaksızın, aynı anda, birden fazla gen üzerinde, büyük bir homojenlikle ve eski haline çevrilebilecek bir şekilde yapabiliriz. Bu, gen ifadelerini kontrol edebilmemiz için harika bir araç.”
Genetik Mühendisliği 2.0
Klasik CRISPR-Cas9 sistemi, bakterilerin bağışıklık sistemlerinde bulunan Cas9 adlı bir DNA kesme proteini kullanır. Sistem, Cas9 proteinlerinin DNA zincirinde küçük kırılmalar oluşturduğu, tek bir kılavuz RNA kullanılarak insan hücrelerindeki belirli genlere hedeflenebilir. Daha sonra hücrede mevcut olan onarım makinesi DNA kesiklerinin oluşturduğu boşlukları onarır ve kesilmiş DNA’yı birleştirir. Bu yöntemler temeldeki DNA dizisini değiştirdiği için kalıcıdırlar. Ayrıca, bir noktadan sonra bu yöntemin hücrenin kendi onarım mekanizmasına bırakılması, sonucu istenen tek bir değişiklikle sınırlamanın zor olduğu anlamına gelir. Weissman, “CRISPR-Cas9 güzel olduğu kadar, onarımı, karmaşık ve çok yönlü olan doğal hücresel işlemlere devretmesi nedeniyle sonuçları kontrol etmenin oldukça zor olduğu bir yöntem” açıklamalarında bulunuyor.
Araştırmacılar, bu çalışmayı DNA dizilerinin kendisini değiştirmeyen, ancak hücrede okunuşlarını değiştiren farklı türde bir gen düzenleyici için bir fırsat gördüler. Bu tür bir modifikasyon, genlerin, DNA zincirindeki kimyasal değişikliklere bağlı olarak susturulabilir veya aktive edilebilir olduğu, bilim insanlarının “epigenetik” olarak adlandırdığı bir modifikasyondur. Bir hücrenin epigenetiği ile ilgili sorunlar, Frajil X sendromu ve çeşitli kanserler gibi birçok insan hastalığından sorumludur ve nesiller boyunca aktarılabilir.
Epigenetik gen susturma genellikle metilasyon yoluyla çalışır (kimyasal etiketlerin DNA zincirindeki belirli yerlere eklenmesi) ve bu gen susturma işlemi RNA polimeraz adı verilen enzimin DNA’ya ulaşamamasına neden olur. RNA polimeraz enzimi normalde DNA dizisindeki genetik bilgiyi okuyup, bu bilgi ile mesajcı RNA senteztezleyen bir enzimdir. Üretilen mesajcı RNA’lar ise protein üretiminde taslak olarak kullanılabilirler. Ancak, epigenetik gen susturma ile RNA polimeraz DNA’ya ulaşamaz ve o genin proteinin üretilememesine neden olur.
Weissman ve meslektaşları daha önce “CRISPRi” ve “CRISPRa” adında başka iki epigenetik düzenleyici oluşturmuşlardı -ancak her ikisi de bir uyarı ile geldi: Hücrelerde çalışabilmeleri için, hücrelerin değişiklikleri sürdürmek için sürekli olarak yapay proteinler sentezlemesi gerekiyordu.
Gilbert, “Bu yeni CRISPRoff teknolojisi ile hücre tarafından sonsuza kadar hatırlanan ve yürütülen bir program yazmak için bir proteini kısa süreliğine sentezleyebilirsiniz. Temelde hücre bölünmeleri ile aktarılan bir değişiklik oluşturuyorsunuz. Bazı yönlerden daha güvenli ve aynı derecede etkili bir CRISPR-Cas9 (sürüm 2.0) oluşturmayı öğrenebiliriz ve tüm diğer şeyleri de yapabiliriz” diyor.
CRISPRoff ve CRISPRon
Araştırmacılar, doğal DNA metilasyonunu taklit edebilecek bir epigenetik düzenleyici oluşturmak için, küçük RNA’lar tarafından yönlendirilen, metil gruplarını iplikteki belirli noktalara yapıştırabilen küçük bir protein makinesi yarattılar. Bu metillenmiş genler “susturulmuş’’ veya kapatılmış olur, bu nedenle bu protein makinesine “CRISPRoff” adı verildi.
Bu yöntem, DNA zincirinin dizisini değiştirmediğinden, araştırmacılar, “CRISPRon” adını verdikleri bir yöntemle metil gruplarını çıkarabilen enzimleri kullanarak susturma etkisini tersine çevirebilirler.
Araştırmacılar “CRISPRoff”u farklı koşullarda test ettiklerinde, yeni sistemin birkaç ilginç özelliğini keşfettiler. Öncelikle, yöntemi insan genomundaki genlerin büyük çoğunluğuna hedefleyebildiler ve bu sadece genlerin kendileri için değil, aynı zamanda protein kodlamayan ancak gen ekspresyonunu (ifadesini) kontrol eden diğer DNA bölgeleri için de işe yaradı. Makalenin ilk yazarı Nuñez, “Bu bizim için bile büyük bir şok oldu, çünkü bunun yalnızca bir gen alt kümesi için geçerli olacağını düşündük” diyor.
Ayrıca araştırmacılar için şaşırtıcı bir şekilde CRISPRoff, daha önce herhangi bir DNA metilasyon mekanizması için gerekli olduğu düşünülen “CpG adaları” adı verilen büyük metillenmiş bölgelere sahip olmayan genleri bile susturmayı başardı. Gilbert, “Bu çalışmadan önce CpG adasına sahip olmayan genlerin yüzde 30’unun DNA metilasyonu tarafından kontrol edilmediği düşünülüyordu. Ama bizim çalışmamız, metilasyon yoluyla genleri kapatmak için bir CpG adasına ihtiyacınız olmadığını açıkça gösteriyor. Bu benim için büyük bir sürpriz oldu” diyor.
Araştırmada ve Terapide CRISPRoff’un Rolü
Bilim insanları, “CRISPRoff”un pratik uygulamalardaki potansiyelini araştırmak için bu yöntemi indüklenmiş pluripotent kök hücrelerinde test ettiler. Bu hücreler, maruz kaldıkları kokteyle (bir grup molekül) bağlı olarak vücutta sayısız hücre tipine dönüşebilen hücrelerdir ve bu nedenle belirli hücre tiplerinin gelişimini ve işlevini incelemek için güçlü modellerdir.
Araştırmacılar, kök hücrelerde susturmak için bir gen seçti ve ardından onları nöron adı verilen sinir hücrelerine dönüştürmek için özel moleküller ile uyardı. Nöronlarda aynı gene baktıklarında, hücrelerin yüzde 90’ında sessiz kaldığını keşfettiler ve hücre tipini değiştirseler bile hücrelerin CRISPRoff sistemi tarafından yapılan epigenetik modifikasyonların belleğini koruduklarını ortaya çıkardılar.
Ayrıca CRISPRoff’un tedavilerde nasıl uygulanabileceğinin örneğini göstermek için Alzheimer hastalığının sebebi olduğu düşünülen Tau proteinini kodlayan geni hedef olarak seçtiler. Yöntemi nöronlarda test ettikten sonra, CRISPRoff’un gen ifadesini tamamen susturamasa da Tau gen ifadesinin seviyesini düşürmek için kullanılabileceğini gösterdiler. Weissman, “Gösterdiğimiz şey, bunun Tau’yu susturmak ve bu proteinin ifade edilmesini önlemek için geçerli bir yöntem olduğuydu. Öyleyse soru şu ki, bunu bir yetişkine nasıl verebiliriz ve Alzheimer’ı etkilemek için gerçekten yeterli olur mu? Bunlar cevaplanması gereken büyük sorular, özellikle ikincisi” diyor.
CRISPRoff, Alzheimer tedavisinde kullanılmasa bile, potansiyel olarak uygulanabileceği başka birçok yöntem var. CRISPRoff gibi teknolojileri belirli dokulara ulaştırmak/uygulamak aşılması gereken bir zorluk olmaya devam ederken, Weissman “Onu bir DNA veya RNA olarak geçici (transit) bir şekilde iletebileceğimizi gösterdik, Moderna ve BioNTech koronavirüs aşısının temelini oluşturan teknolojinin aynısı” diyor.
Weissman, Gilbert ve meslektaşları, CRISPRoff’un araştırmadaki potansiyeli konusunda da oldukça heyecanlılar. Weissman, “Artık genomun istediğimiz herhangi bir bölümünü susturabildiğimiz için, genomun işlevini keşfetmek için bu harika bir araç” diyor.
Ayrıca, bir hücrenin epigenetiğini değiştirmek için güvenilir bir sisteme sahip olmak, araştırmacıların epigenetik modifikasyonların hücre bölünmelerinde hücreden hücreye aktarılmasını sağlayan mekanizmaları öğrenmelerine yardımcı olabilir. Nuñez, “CRISPRoff’un, kalıtım mekanizmasını, özellikle de biyomedikal bilimlerde büyük bir soru olan epigenetik kalıtsallığı incelemeye başlamamıza izin verdiğini düşünüyorum” diyor.
Kaynak: https://phys.org/news/2021-04-reversible-crispr-method-gene-underlying.html
